Na IBISS-u počele vežbe!

Dugo očekivane i najavljivane vežbe na Institutu za biološka istraživanja Siniša Stanković su otpočele. Zahvaljujući voljnim i posvećenim istraživačima ovog eminentnog, naučnog centra studenti, članovi SSN, imali su priliku da steknu uvid u postupak i metode naučnog rada.

Vežbe su otpočele u utorak, 25.10.2011. i planirano bile podeljene u dva termina. Studenti su bili pozvani da posmatraju odrađivanje kortikalne lezije laboratorijskim životinjama (pacovima) i njihovom žrtvovanju, dva dana kasnije. 

Institut za biološka istraživanja Siniša Stanković

Prvog dana vežbi (utorak, 25. X 2011.) u planu je bilo odrađivanje unilateralnih kortikalnih lezija laboratorijskim životinjama koje bi studenti posmatrali. Ove lezije rade se kako bi se ispitala ekspresija hemikanala za ATP i receptora za Adenozin, što je i cilj samog rada. Životinje su podeljene u dve grupe – eksperimentalnu i kontrolnu. Na eksperimentalnoj grupi obaviće se operacija dok se na kontrolnoj grupi životinja neće obavljati nikakav postupak.

Pre operacije životinje su anestetisane mešavinom ketamina i benzodijazepina koja se koristi i tokom veterinarskih intervencija. Standardno je da se eksperimenti obavljaju na životinjama istog pola. Naše životinje bile su mužjaci (ukoliko se koriste ženke, one se pre procedura ovarijektomišu ili im se prati ciklus). Mešovite grupe životinja koriste se isključivo kada se upoređuju razlike među polovima. Važno je, takođe, da životinje budu slične mase zbog validnosti rezultata kao i zbog izračunavanja količine anestetika. Naše životinje težile su, oko 350 g.

Stereotaksički sistem

Sama operacija počinje nakon što anestetik počne da deluje. To se ispituje bolnim nadražajem (štipanjem za rep), kornealnom osetljivošću i posmatranjem da li se životinji pomeraju brkovi. Kada je životinja „pala“ ona se pričvršćuje za stereotaksički aparat. To je uređaj kojim se pričvršćuje glava životinje, kako se tokom procedure ne bi pomerala. Držačima se, sa obe strane, lobanja životinje pričvršćuje i to u regiji ramusa mandibule (u protokolima se navodi da šipke za pričvršćivanje treba provući kroz spoljašnje ušne kanale, do probijanja bubne opne, ali se to ovde nije radilo kako bi se minimalizovala patnja životinja, pošto se ista jednako dobro pričvrsti i na gorenavedeni način). Po pričvršćivanju krzno se, sa glave, skloni i pristupa se operaciji. Operacija otpočinje vertikalnim rezom koji ide od ravni očiju do ravni ušiju, sredinom glave. Koža se, potom, razmakne i preseče se struktura koja kod čoveka odgovara epikranijalnoj aponeurozi. Vodonik peroksidom se, potom, kosti epikranijuma očiste kako bi se našla bregma. Na osnovu nje se istraživači orijentišu. Kada je bregma vidljiva, na osnovu milimetarskog papira i stereotaksičkog atlasa pronalazi se željena oblast koja se, potom, obeležava. U našem slučaju to je bila somatosenzorna kora. Na obeleženom mestu pravi se kortikalna lezija, bušilicom sa graničnikom (3 mm) koja probija kost i korteks ali ne i moždanu komoru.

Pravilno fiksirana životinja

Pacovi se, posle operacije, ušivaju. Nakon dva dana prva grupa eksperimentalnih i grupa kontrolnih pacova biće žrtvovana dok će druga grupa eksperimentalnih životinja biti žrtvovana nakon sedam dana. Ovo se radi kako bi se videla progresija promena u lezijama u vremenskom razmaku.

Drugog dana vežbi (27. X 2011.) kontrolna grupa pacova i prvi deo eksperimentalne grupe je žrtvovan. Žrtvovanje se obavlja nakon anestezije pacova. Korišćena je ista smeša, u tu svrhu. Nakon što je životinja „pala“ pribegava se sistemskoj perfuziji krvotoka fiziološkim rastvorom. Ovo se obavlja kako bi se „isprao“ mozak i, na taj način, analiza osigurala od ukrštenih reakcija  koje bi mogle da poremete, vrlo osetljive metode, molekularne analize. Takođe, na ovaj način odlaže se proteoliza i procesi putrifikacije pošto hladan fiziološki rastvor inaktiviše enzime.

Perfuzija se obavlja nakon što se pacov pričvrsti za podlogu. Životinji se otvore grudni koš i abdomen i preseče zid desne pretkomore. U levu komoru se plasira igla povezana sa sistemom napunjenim fiziološkim rastvorom. Fiziološki rastvor se, kroz levu komoru, uz pomoć srca potiskuje u sistemsku cirkulaciju dok krv ističe kroz desnu pretkomoru. Nakon što srce stane, špricem se fiziološki rastvor, dalje, forsira u krvotok. Postupak se sprovodi dok se životinja potpuno ne „očisti“ što se može videti bledoćom jetre i obezbojavanjem očiju (oči su, inače, jarko crvene). 
 Nakon perfundovanja životinje su bile dekapitovane i sa njihovih mozgova su uklonjeni delovi u regiji lezije. Kontrolnoj grupi uklonjeni su isti delovi na kojima je, u eksperimentalno grupi, načinjena lezija (somatosenzorni korteks).

Uzeti uzorci se stavljaju u posebne sudove, oblažu aluminijumskom folijom i konzerviraju na -80° C. Nakon izvesnog vremena oni će biti homogenizovani i podvrgnuti Western blot analizi kako bi se otkrila ekspresivnost hemikanala za ATP i receptora za adenozin.

          II deo vežbe

Na ovom delu inicijalno je planirano posmatranje operacije ubrizgavanja toksina u mozak pacova ali je procedura, zbog tehničke nemogućnosti, obavljena ranije. Dobili smo, međutim, teorijski uvid u to šta je rađeno životinjama.

Iz sestrinske laboratorije objašnjeni su nam eksperimenti koji se tiču patologije spavanja i Alchajmerove bolesti, kojima se oni bave. 


U ovim eksperimentima posmatraju se budno stanje, spavanje - nREM i REM faza.

Posmatrali smo i atlas za stereotaksički aparat sa koordinatama pozicija određenih struktura u mozgu.

Na pacovima koji se ispituju se stvara lezija iboteničnom kiselinom ( 100 nL 0,1M), a otvor u lobanji se zatvara šrafom kako bi se sprečila moguća infekcija. Lediranje se vrši na holinergičkoj strukturi – nucleus basalis. Pošto ova kiselina difunduje kružno, koristi se veoma mala zapremina da dijametar difundovanja ne ošteti i neželjene strukture pa se tako dobiju pogrešni rezultati. 

U leziju se plasira elektroda koja se završava konektorom. Njena svrha je registrovanje električne aktivnosti mozga iz različitih regija. Ispituje se REM faza sna koju karakteriše atonija mišića i značajna aktivnost mozga. Koristi se 7 elektroda i konektor, dok su tzv. „šraf elektrode“ domaća radinost laboratorije. Dve nedelje traje oporavak pacova od operativnog zahvata, a ispitivanje tj. registracija  počinje 14. dana nakon lezije. Pacovi se „kače“ na aparat za registrovanje i ono se beleži tokom 6h njihovog sna koji je u osunčanom delu dana. Pacovi imaju tzv. „hat set“ i za dva pacova koristi se 16-o kanalni sistem registrovanja. 

U rezultatu se dobija da sa lezijama opada vremensko trajanje REM faze. 

U istraživanju Alchajmera primenjuje se ibotenična kiselina na nucleus basalis. Ustanovljeno je propadanje holinergičkog sistema sa starenjem. 5 do 10 godina pre pojave Alchajmerove bolesti javljaju se promene u nucleus basalis-u.

Ovakvi zahvati retko se registruju preko 35 dana zbog tehničkih nesavršenosti aparature za registrovanje (pacovima „otpadnu“ konektori za elektrode), tako da se teško dokazuje starenje. Međutim potvrđen je značaj nucleus basalis-a u etiologiji Ajchajmera.

Signali koji se dobijaju u ovim eksperimentima su veoma iskoristljivi.

Saradnja između Studentske sekcije za neuronauke (SSN) i IBISS-a je veoma značajan korak u daljoj integraciji SSN i Društva za neuronauke Srbije. Nadamo se da će ta saradnja, u vremenu koje sledi, izneti još mnogo značajnih, zajedničkih projekata. 

Na kraju, zahvaljujemo se Ivani Bjelobabi i Ani Parabucki na volji da nam pokažu postupke rada, na strpljenju koje su imale dok su odgovarale na sva naša pitanja i nedoumice, kao i kolektivu IBISS-a koji nam je pružio gostoprimstvo i omogućio nam da naučimo nešto novo.

by
Borko Gobeljić
Vesna Đoković